35  Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie

35.1  Lernziel

Die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie wurde in den frühen Siebzigerjahren entwickelt, ist aber aufgrund technischer Entwicklungen, erst in den letzten Jahren interessant geworden. In Verbindung mit einer konfokalen Optik kann Licht aus einem sehr kleinen Volumenelement von nur 1μm³ (oder 1fl) zur Spektroskopie herangezogen werden, und somit Proben in ebd. Volumen untersucht werden. Aus diesem Grund wuchs die FCS in den letzten Jahren zu einer sehr leistungsfähigen Methode heran, um dynamische Prozesse von gelösten Molekülen zu untersuchen. Die Vorteile liegen in der hohen Auflösung, so dass eventuell sogar einzelne Moleküle betrachtet werden können, in der geringen benötigten Probenmenge und der kurzen Aufnahmezeit von nur wenigen Sekunden.

Das Funktionsprinzip eines Fluoreszenz-Korrelations-Spektrometers ist folgendes: Durch sehr gute Fokussierung eines Lasers in einer Flüssigkeit und späteren Strahlengang durch ein Pinhole wird ein sehr kleines Beobachtungsvolumen aus der Flüssigkeit herausgegriffen. Fluoreszenz-Photonen aus diesem Volumen werden in Abhängigkeit der Zeit gezählt. Nun analysiert man die Intensitätsschwankungen des Fluoreszenzlichts. Diese hängen natürlich von den Fluktuationen der fluoreszierenden Moleküle ab, welche durch Bewegung der Teilchen aufgrund von Diffusion (Brown’sche Bewegung) oder Reaktionen der Moleküle in einen nichtfluoreszierenden Zustand (z.B. Triplettzustand) verursacht werden. Aus diesem Grund kann man mit FCS z.B. Diffusionskoeffizienten oder Ratenkonstanten für photophysikalische und chemische Reaktionen bestimmen.

Wichtig für ein Fluoreszenz-Korrelations-Experiment ist die sogenannte Autokorrelationsfunktion G. Diese beschreibt die Selbstähnlichkeit des Fluoreszenzsignals zu verschiedenen Zeiten t und t + τ und liefert damit Informationen über die Zeitskalen der beteiligten Prozesse. Dazu werden die Fluktuationen δF = F - (Abweichung der momentanen Fluoreszenz vom Mittelwert) eines bestimmten Zeitpunktes t mit den Fluktuationen des Zeitpunktes t + τ multipliziert. Normiert ergibt sich dann folgende Form:

(35.1)

Der zeitliche Verlauf von G enthält nun Informationen über die charakteristischen Zeiten der beteiligten dynamischen Prozesse¹ .

35.2  Lerninhalte

1. Diffusion und Brownsche Bewegung
2. Fluoreszenzfarbstoffe
3. Optische Messung der Fluoreszenz
4. Autokorrelationen und der Zusammenhang mit Diffusion und Chemische Reaktion

35.3  Aufgaben

35.3.1  Erster Versuchstag:

1. Bestimmung des Beobachtungsvolumens mit Rhodamin 6G
   • Legen Sie ein Deckglas als Justierprobe auf und optimieren Sie den konfokalen Aufbau mithilfe des Reflexes der Glas-Luft Grenzfläche des Deckglases.
   • Präparieren Sie eine „Sandwich-Probenkammer“ aus 2 Deckgläsern, beschichten Sie diese mit BSA (Rinderserum-Albumin) und führen Sie zunächst FCS-Messungen an einer 20nM Rh6G-Lösung in Wasser bei geringer Laserleistung (ca. 50μW) durch.
   • Bestimmen Sie aus diesen Messungen mit Hilfe des bekannten Diffusionskoeffizienten für Rhodamin 6G die Geometrie des konfokalen Volumens und die Konzentration der Rhodaminprobe.
   • Wiederholen Sie die Messungen bei höherer Intensität (Laserleistung zwischen 100μW und 500μW). Wie verändert sich die effektive Teilchenzahl im konfokalen Volumen und die Korrelationszeit? Wie lassen sich diese Veränderungen erklären?
   • Bauen Sie statt des 50μm Pinholes nun ein Pinhole mit 30μm Durchmesser ein und charakterisieren Sie für diese Geometrie Form und Größe des konfokalen Volumens.

35.3.2  Zweiter Versuchstag:

1. Bindung eines fluoreszenten Oligonukleotids an seinen Komplementärstrang
   • Führen Sie FCS-Messungen an einer Lösung aus Alexa555-fluoreszenzmarkierten, kurzen DNA-Strängen (Oligonukleotiden) durch, die aus 8 Basen (5’-GGTGAATG) bestehen. Bestimmen Sie den hydrodynamischen Radius der Oligonukleotide.
   • Untersuchen Sie nun einige Proben, die zusätzlich verschiedene Konzentrationen (5nM bis 5μM) eines komplementären Oligonukleotids enthalten, welches durch Kopplung an ein Streptavidin-Molekül eine wesentlich größere Masse (geringere Beweglichkeit) hat.
   • Tragen Sie die gemessenen Korrelationszeiten über der Konzentration auf und ermitteln Sie die Bindungskonstante (Dissoziations-Gleichgewichtskonstante). Ermitteln Sie aus der Korrelationszeit bei Bindungssättigung den hydrodynamischen Radius der gebundenen Spezies.
   • Schätzen Sie aus der ermittelten Bindungskonstante die Ratenkonstante für die Dissoziation (k_off) der DNA-Stränge ab, indem Sie eine diffusionskontrollierte Assoziation annehmen (k_on ≈ 10⁸M^-1s^-1). Vergleichen Sie diese mit der Biotin-Streptavidin-Bindung!

35.4  Literatur

C. Röcker, G.U. Nienhaus

Ausführliche Anleitung zum Versuch

R. Rieger, C. Röcker, G.U. Nienhaus

„Fluctuation correlation spectroscopy for the advanced physics laboratory“ Am. J. Phys. 73, 1129-1134 (2005)

A. Schenk

„Fluorescence fluctuation spectroscopy - Theoretical basis, experimental realization and applications to biomolecular systems“Dissertation, Ulm 2003

E. Haustein, P. Schwille

„Ultrasensitive investigations of biological systems by fluorescence correlation spectroscopy“ Methods 29, 153 - 166 (2003)

R. Rigler, E.S. Elson (Eds.)

„Fluorescence Correlation Spectroscopy, Theory and Applications“ Springer, 2001, ISBN 3-540-67433-0

A. Einstein

„Über die von der molekularkinetischen Theorie der Wärme geforderte Bewegung von in ruhenden Flüssigkeiten suspendierten Teilchen“ Ann. Phys. 17, 549-460 (1905)